【儀表網(wǎng) 儀表研發(fā)】囊泡胞吐作用是一個(gè)快速的動(dòng)態(tài)過程，通過控制囊泡包裹的活性肽或神經(jīng)遞質(zhì)向細(xì)胞外部釋放，從而調(diào)節(jié)重要的生理功能。目前對(duì)囊泡胞吐的檢測(cè)技術(shù)主要包括電生理和光學(xué)成像的方法。基于膜片鉗的電生理檢測(cè)技術(shù)可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞的胞吐事件進(jìn)行檢測(cè)，該技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)是操作的時(shí)間分辨率高，可在毫秒尺度上檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中囊泡的胞吐事件。然而，電生理檢測(cè)技術(shù)主要用于離體單個(gè)細(xì)胞或腦片中單個(gè)細(xì)胞的檢測(cè)，較難實(shí)現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞的同時(shí)檢測(cè)及在體監(jiān)測(cè)。另外，膜片鉗技術(shù)檢測(cè)的是單個(gè)細(xì)胞中多個(gè)囊泡胞吐的表觀事件，無法對(duì)單個(gè)囊泡的錨定和融合過程進(jìn)行觀察和檢測(cè)。而基于光學(xué)成像的檢測(cè)技術(shù)可以同時(shí)對(duì)多個(gè)細(xì)胞中的囊泡胞吐事件進(jìn)行追蹤和記錄，該技術(shù)還可以對(duì)單個(gè)囊泡的胞吐事件進(jìn)行檢測(cè)，這對(duì)于在分子水平揭示囊泡與質(zhì)膜錨定、融合的調(diào)控機(jī)理十分重要。在此過程中，熒光蛋白融合標(biāo)記為顯微成像提供了有力工具。與可透膜的熒光染料相比，熒光蛋白成像背景低、信噪比高、生物毒性低、表達(dá)量可控，是活細(xì)胞成像的首選。
 

　　成熟的囊泡腔內(nèi)為酸性pH環(huán)境(pH約為5.6)。囊泡胞吐時(shí)，囊泡膜與質(zhì)膜發(fā)生融合，腔內(nèi)pH瞬間切換為偏堿性的細(xì)胞外環(huán)境(pH約為7.4)?；诖颂匦?，科學(xué)家通過氨基酸突變及篩選，最終獲得pH敏感型GFP突變體pHluorin，目前已被廣泛用于檢測(cè)突觸囊泡、分泌小泡和再循環(huán)內(nèi)體的胞吐作用。然而，由于發(fā)生膜融合前，位于質(zhì)膜附近囊泡內(nèi)的pHluorin熒光信號(hào)弱，限制了其追蹤囊泡錨定步驟的應(yīng)用。此外，現(xiàn)有的紅色pH敏感熒光蛋白探針與pHluorin相比，pH敏感性相差甚遠(yuǎn)。其中，pHuji的性質(zhì)相對(duì)較好，但該蛋白熒光強(qiáng)度低且具有快速的熒光衰減特性，其熒光強(qiáng)度在<2s的連續(xù)照明下即降到初始熒光的35%，不適合囊泡分泌檢測(cè)和動(dòng)力學(xué)跟蹤。
 

　　中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所研究員徐平勇課題組在Nature Communications上，發(fā)表了題為pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps的研究文章。該研究開發(fā)出一個(gè)亮度高、穩(wěn)定性好、pH敏感性強(qiáng)的紅色熒光蛋白探針pHmScarlet。該探針在現(xiàn)有紅色熒光蛋白中具有最高的pH敏感性，能檢測(cè)到更多的分泌事件，并且可同時(shí)可視化分泌事件中的囊泡錨定和融合步驟。在用于囊泡分泌事件檢測(cè)時(shí)，pHmScarlet具有與綠色pH敏感熒光蛋白pHluorin媲美的分泌信號(hào)。此外，pHmScarlet還具有pHluorin不具備的檢測(cè)能力。pHmScarlet的pKa值使得其在酸性條件下可檢測(cè)完整囊泡中的熒光強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對(duì)囊泡錨定步驟的追蹤和記錄。該探針還可以與pHluorin結(jié)合，對(duì)多個(gè)囊泡蛋白進(jìn)行雙色成像。此外，盡管pHmScarlet的發(fā)射波長(zhǎng)與pHluorin相比明顯紅移，但其空間分辨率足夠高，可以使用Hessian結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(Hessian-SIM)進(jìn)行超高分辨率成像，解析出囊泡融合孔的環(huán)形結(jié)構(gòu)?？梢灶A(yù)測(cè)，該pH敏感紅色熒光蛋白探針將在囊泡分泌與運(yùn)輸領(lǐng)域有更廣泛的應(yīng)用。
 

　　該研究由中科院生物物理所、北京大學(xué)、中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所等合作完成。研究工作得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)，以及中科院科研儀器設(shè)備研制等的支持。