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免疫沉淀過程中需要注意的幾個關(guān)鍵影響因素

時間:2017-4-28閱讀:254
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1、進(jìn)口原裝elisa試劑盒樣品處理的質(zhì)量

   免疫沉淀實驗成功的關(guān)鍵在于*步樣品處理。免疫沉淀實驗本質(zhì)是處于天然構(gòu)象狀態(tài)的抗原和抗體之間的反應(yīng),而樣品處理的質(zhì)量決定了抗原抗體反應(yīng)中抗原的質(zhì)量,如抗原的豐度及抗原的構(gòu)象狀態(tài)。
   樣品處理應(yīng)根據(jù)抗原樣品的來源如組織樣品、細(xì)胞或其他形式的樣品,選擇適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行細(xì)胞或組織破碎,使待檢抗原釋放至樣品溶液中。裂解緩沖液的使用應(yīng)注意添加合適的蛋白酶抑制,避免抗原或抗原-其他分子復(fù)合物被降解,另外,應(yīng)選用去垢劑強(qiáng)度合適的裂解液,既保證有效裂解細(xì)胞釋放抗原又不破壞蛋白質(zhì)之間的相互作用。

2、抗體的選擇
   在考慮抗體特異性的同時,還需考慮抗體對抗原的親和力,如單克隆抗體只對抗原的單一表位具有良好的特異性,因此在免疫沉淀中如果抗原表位暴露不充分,受到破壞,或受其他因素影響,造成抗體不能識別抗原,無法有效形成免疫沉淀復(fù)合物,那么這將直接影響免疫沉淀的結(jié)果。而多克隆抗體或混合單克隆抗體可以和抗原的多個表位結(jié)合,從而解決親和力的問題。但是,并不是所有抗體都能用于免疫沉淀,進(jìn)口原裝elisa試劑盒應(yīng)選用經(jīng)IP實驗驗證后的抗體以確保實驗結(jié)果的可靠性。此外,不同類型、同類不同亞型的抗體對蛋白 A或G的親和力不同,應(yīng)選擇合適的抗體及微球用于免疫沉淀。

3、微球的選擇
   目前廣泛應(yīng)用于免疫沉淀的微球以結(jié)合了蛋白 A或G的瓊脂糖和磁性微球為主。瓊脂糖材料是無色透明、粒徑達(dá)微米級的具有多孔表面的微球,有巨大的表面積,蛋白結(jié)合量高,曾一度成為免疫沉淀技術(shù)中的主要材料。但在免疫沉淀操作中需要采用離心的方法達(dá)到固液分離,而反復(fù)離心產(chǎn)生的物理應(yīng)力極易破壞蛋白的天然構(gòu)象及完整性,且由于瓊脂糖本身容易破碎,不易保存,限制了瓊脂糖微球在免疫沉淀中的發(fā)展。相比之下,磁性微球其核心為超順磁性粒子,核心外層包裹一層高分子材料,表面平滑,粒徑可達(dá)納米級,比表面積大,單位重量的微球蛋白結(jié)合量更大。超順磁性微球可以在外加磁場中表現(xiàn)磁性,實現(xiàn)快速有效分離,大大縮短實驗操作時間。溫和的磁性分離方式避免反復(fù)離心對蛋白天然構(gòu)象及完整性的破壞。超順磁性微球在增大機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性的同時,縮減了產(chǎn)品造價。上述的優(yōu)勢使超順磁性微球成為免疫沉淀試劑盒行業(yè)的新秀,進(jìn)口原裝elisa試劑盒逐漸被研究者所采用。

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