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技術(shù)文章

酶符號(hào)抗體作業(yè)濃度的選擇

閱讀:223發(fā)布時(shí)間:2017-11-6

在免疫酶技術(shù)中,首先要斷定的變異要素就是酶符號(hào)物的作業(yè)濃度。因?yàn)槊阜?hào)物濃度的很小改變,便可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)成果發(fā)生很大的波動(dòng)。別的,因?yàn)闈舛冗^(guò)高,可使非特異性反響添加,而濃度過(guò)低又可影響測(cè)定的敏感性。因此,正式實(shí)驗(yàn)前有必要滴定其作業(yè)濃度。
(一)酶符號(hào)抗體的滴定辦法:將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上,然后將經(jīng)過(guò)一系列稀釋的酶標(biāo)抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反響,以酶與底物的顯色反響程度來(lái)斷定酶符號(hào)抗體的效價(jià),或稱作業(yè)濃度。
(二)過(guò)程:先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg/ml左右,于聚苯乙烯板孔內(nèi)加0.1ml,4℃過(guò)夜,次日以洗刷緩沖液洗刷3次。酶符號(hào)抗體用1%BSA-PBS液順次稀釋成1:100,1:200,1:400,1:800,1:1600(依據(jù)據(jù)抗體的滴度而定),分別參加反響孔中,每個(gè)稀釋度二孔,每孔0.1ml,37℃孵育1小時(shí)后洗刷。然后加底物液,每孔0.1ml,37℃10~30分鐘。以2M H2SO4 0.05ml終止反響。
(三)成果斷定:主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值,并以O(shè)D為縱座標(biāo),結(jié)合物濃度為橫座標(biāo),制作滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右,且曲線斜率zui大時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋度,即為該符號(hào)物的作業(yè)濃度。
注意事項(xiàng)
1. 在具有高質(zhì)量HRP的條件下,所要符號(hào)的抗體也要活性高、效價(jià)高(zui低1:16)、純度高、親和力好,這是保證符號(hào)物效價(jià)高,免疫活性好的首要條件。
2. 所運(yùn)用試劑的PH和濃度及用量有必要嚴(yán)厲把握。所用試劑,(或必需)新鮮制造。如在戊二醛符號(hào)法中所用戊二醛應(yīng)為新鮮純品,因戊二醛貯存過(guò)久可構(gòu)成縮和體(雜質(zhì))。不然,影響符號(hào)作用。
3. 室溫?cái)嚢钑r(shí)須避光,室內(nèi)溫度一般在25℃為宜。符號(hào)物每次透析前,須認(rèn)真查看,避免漏液。
4. 濃的符號(hào)物相當(dāng)安穩(wěn),常參加30-40%甘油于-10℃下保存。4℃可保存1-2年,但稀釋成1:10,只能保存數(shù)周。已制造的運(yùn)用液應(yīng)在12小時(shí)內(nèi)用完。切忌反復(fù)凍融。


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