流動相： a、溶劑必須是HPLC級的，試劑則盡可能使用高純度的； b、不與固定相發生化學反應，粘度小，且對樣品有適宜的溶解度，要求 k 在1～10范圍內（可用范圍）或2～5（*范圍），k 值太小，不利于分離；k 值太大，可能使樣品在流動相中沉淀； c 、 流動相使用之前必須過濾和脫氣； d、確保溶劑間是相互混溶的； e、流動相必須與檢測器相匹配，如用紫外檢測器時，不能選用截止波長大于檢測波長的溶劑。 痕量的雜質會極大地降低色譜柱的性能，當需要更換流動相時，確保溶劑（緩沖液）之間是相互混溶的。若使用的溶劑與色譜柱中的溶劑不能混溶，則需使用過渡溶劑，否則會對色譜柱產生*性的傷害。鹽或緩沖液從流動相中析出也會對色譜柱產生*性的傷害。每次進樣前應該檢查樣品在流動相中的溶解性，如果可能盡量使用流動相溶解樣品。 ②、固定相： a、流動相的pH值應保持在2.0－8.0之間（除非有特殊說明）； b、如果有必要可使用預飽和柱和保護柱； c、使用氨基柱時，流動相和樣品中盡量避免含醛類和酮類物質。 當前的反相色譜柱填料可分為以下三種： ⒈硅膠柱：柱效高，機械強度大，但對pH敏感，低pH值（<2.0）會使鍵合相水解（除去鍵合的功能集團）；高pH值（>8.0），硅膠溶解。如果流動相的pH值接近2.0或8.0，需要使用預飽和柱。 ⒉有機聚合物填料：在寬pH范圍內穩定，殘留硅羥基效應較小；但其柱效低，機械強度不高，在不同的溶劑中可能縮水或溶脹。在應用過程中，壓力不能超過其zui大能承受的限制，且流動相中有機溶劑如甲醇、異丙醇、乙醇的含量不能超過10％。 ⒊有機－無機雜化粒填料：新開發的一種新型填料，由兩種高純的單體（有機聚合物和無機硅烷）合成的高純度填料，此類填料將硅膠填料和有機聚合物填料的優點有機地結合起來，柱效高、機械強度高、穩定性好、pH范圍寬，特別是表面和顆粒內部的硅羥基大部分被有效的屏蔽，使其對堿性物質的保留性能非常好。 ③、背壓（backpressure）和流速： a、保持背壓低于3500psi（245bar）； b、避免任何突然的壓力變化； c、如果背壓高（>3500psi），可反沖色譜柱，但流速應為正常流速的1/5-1/2； d、如果檢測池需要除氣，可以使用背壓調控器（backpressure regulator）。 為zui大限度的延長色譜柱的壽命，可根據色譜柱的填料的粒徑、色譜柱的內徑對流速進行調整，使得背壓<3500psi。如果背壓不超過界限，色譜柱的流速可任意設定