同科生物同源重組試劑盒實驗中常見問題與解決方案

一、平板上無克隆或克隆數目很少

1、可能的原因：引物序列不正確

解決方案：確認引物序列含有15 bp與載體插入區域*一致的同源序列。

2、可能的原因：PCR產物不純

解決方案：優化PCR擴增反應以得到單一PCR產物；換一種純化方法，純化您的PCR產物。

3、可能的原因：反應體系中DNA濃度太低

解決方案：在重組反應中，加入推薦的DNA量。

4、可能的原因：不純的載體或插入片段抑制重組反應

解決方案：推薦采用膠回收或離心柱法純化DNA后進行重組反應。

5、可能的原因：轉化過程中加入重組反應液過多

解決方案：重組反應液的轉化體積不應超過轉化細胞體積的1/10。

6、可能的原因：感受態細胞轉化效率低

解決方案：更換新鮮、的感受態細胞。

7、可能的原因：培養基中加入錯誤或過多抗生素

解決方案：在轉化平板中加入正確、適量的抗生素。

二、假陽性克隆數目多

1、可能的原因：克隆載體線性化不*

解決方案：重新酶切您的載體，增加酶切時間，并膠回收純化。

2、可能的原因：PCR使用的模板質粒抗性與所需克隆載體抗性相同造成的污染

解決方案：可在PCR反應之前先將模板質粒線性化；PCR產物用DpnI處理，消化模板質粒，然后再純化。

3、可能的原因：轉化用平板放置時間過長導致抗性失效

解決方案：確認平板新鮮配置，并含有正確、適量的抗生素。

三、克隆含有不正確的插入片段

可能的原因：PCR產物混有非特異性片段

解決方案：優化PCR擴增體系，提高特異性或膠回收純化目的片段。