通常來講，real-time qPCR的反應(yīng)程序不需要像常規(guī)的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由于其產(chǎn)物長度在80～150 bp之間，所以只需要變性和退火就可以了。

SYBR@Green等染料法，在PCR擴(kuò)增程序結(jié)束后，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷PCR產(chǎn)物的特異性擴(kuò)增。而溶解程序，儀器都有默認(rèn)設(shè)置，或稍有不同，但都是一個在產(chǎn)物進(jìn)行溶解時候，進(jìn)行熒光信號的收集。同科生物今天給大家分享一下qPCR常見問題。

1、無 Ct 值出現(xiàn)

檢測熒光信號的步驟有誤：一般SG法采用72℃延伸時采集，Taqman法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。

引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性。

模板量不足：對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的zui高濃度做起。

模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。

2、Ct 值出現(xiàn)過晚（Ct>38）

擴(kuò)增效率低：反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計更好的引物或探針；改用三步法進(jìn)行反應(yīng)；適當(dāng)降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。

PCR 各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。

PCR 產(chǎn)物太長： 一般采用80～150 bp的產(chǎn)物長度。

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳

加樣存在誤差：使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。

標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解：應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。

引物或探針不佳：重新設(shè)計更好的引物和探針。

模板中存在抑制物，或模板濃度過高。

4、負(fù)對照有信號

引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

鎂離子濃度過高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。

模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異擴(kuò)增。

5、擴(kuò)增效率低

反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。

反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。

反應(yīng)體系中有 PCR 反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響。

6、擴(kuò)增曲線異常，比如 S 型曲線

參比染料設(shè)定不正確：MasterMix不加參比染料時，選NONE。

模板的濃度太高或者降解。

熒光染料的降解。

7、定量PCR儀的開關(guān)機(jī)順序是怎樣的？

按照正確的開關(guān)機(jī)順序操作，有助于延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。

開機(jī)順序：先開電腦，待電腦*啟動后再開啟定量PCR儀主機(jī)，等主機(jī)面板上的綠燈亮后即可打開定量PCR的收集軟件，進(jìn)行實驗。

關(guān)機(jī)順序：確認(rèn)實驗已經(jīng)結(jié)束后，首先關(guān)閉信號收集軟件，然后關(guān)掉定量PCR儀主機(jī)的電源，zui后關(guān)閉電腦。

9、什么是CT值比較法？數(shù)據(jù)怎么處理？

CT 值與起始DNA濃度的對數(shù)成反比：

如果：不同管之間的PCR反應(yīng)效率相同。這些 PCR 的反應(yīng)效率接近 。可以從上面的公式推出相對含量（X01/X02）= 2 -ΔCT。假設(shè)實驗的目標(biāo)是研究藥物處理后0、24、48小時 IL-2基因在某種組織中的表達(dá)量的變化，所用內(nèi)對照18S RNA基因。IL-2和18S RNA的測定結(jié)果都是CT值，而沒有通過標(biāo)準(zhǔn)曲線測定總RNA的pg數(shù)。　　

10、定量PCR基因表達(dá)的實驗數(shù)據(jù)應(yīng)該如何處理？

總的來說，有三個層次的校正是必須要做的。

參比信號校正。試劑中必須包含固定濃度的 ROX，這樣由于反應(yīng)總體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光性能的差異等所引起的熒光信號波動都能夠被扣除，使數(shù)據(jù)真正反映 PCR 進(jìn)程。ROX 校正能夠極大地改進(jìn)定量的度，提高重復(fù)管之間的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。

內(nèi)對照校正。實驗中加入樣品基本上都是以體積為單位的，但是同樣體積的不同樣品很可能來自不同數(shù)目的細(xì)胞，所以將實驗結(jié)果校正到每個細(xì)胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因（如 IL-2）的同時定量一個內(nèi)對照基因（如 18S RNA 基因），然后 IL-2/18S。內(nèi)對照校正使不同樣品的實驗數(shù)據(jù)可以相互比較。

計算相對于基準(zhǔn)樣品（Calibrator）的相對基因含量。比如研究處理和未處理的、0 小時和 6 小時的、正常和患病的之間的基因表達(dá)的差別，則需要計算處理/未處理、6 小時/0 小時、患病/正常。

11、怎樣判斷定量pcr儀的樣本加熱塊是否被污染？怎樣清除污染？

一個辦法是運行背景校正反應(yīng)板，當(dāng)一個或多個反應(yīng)孔連續(xù)顯示出不正常的高信號，則表明該孔可能被熒光污染物。

另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下，執(zhí)行 ROI 的校正，當(dāng)某個孔的信號明顯高出其他孔時，則表明該孔被污染。

清除樣本加熱塊污染的步驟如下：

用移液器吸取少量乙醇并滴入每個污染的反應(yīng)孔中。

吹打數(shù)次。

將廢液吸入廢液杯中。

重復(fù)以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。

確認(rèn)反應(yīng)孔中的殘留液體蒸發(fā)完。

12、內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法哪種數(shù)據(jù)更精密？

是同樣可靠的。

內(nèi)標(biāo)的優(yōu)點在于目標(biāo)基因與管家基因的反應(yīng)條件zui接近一致，缺點在于目標(biāo)基因與管家基因的引物和探針相互之間會發(fā)生競爭與抑制，導(dǎo)致它們的PCR效率有差異。

外標(biāo)的優(yōu)點在于目標(biāo)基因與管家基因的引物和探針之間沒有發(fā)生競爭與抑制的機(jī)會，但是不同管之間的反應(yīng)條件差異比同管的要大，也會導(dǎo)致它們的PCR效率有差異。

兩相比較，內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法的數(shù)據(jù)度是一樣的。