ELISA試劑盒所謂的單波長比色等于一般的以對顯色具有zui大吸收的波長如450nm或492nm進行比色測定；而雙波長雙色則酶標儀在靈敏波長如450nm和非靈敏波長630nm下各測定一次，靈敏波上下的吸光度測定值為樣本測定酶反響特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、塵埃等臟物所造成的的吸光度之和；非靈敏波長下測定即改動波長至必定值，EELISA試劑盒使得樣本測定酶反響特異顯色的吸光度值為零，此刻測得的吸光度即為臟物的吸光度值。
ELISA試劑盒以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有運用，而前者比色波長為450nm，后者為492nm，濾光片需根據要求隨時替換。zui終酶標儀給出的數值為靈敏波長下的吸光度值與十分感波長下的吸光度值的差。以軟板為載體的實驗，需先將板置于標準96孔的座架中，才可進行比色。ELISA試劑盒比色時應先以蒸餾水校零點，測讀底物孔。
由于ELISA試劑盒測定中單個空缺孔的非特異吸收上有必定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空缺孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，所以在ELISA測定比色時，是運用雙波長比色。ELISA試劑盒因而，雙波長比色測定具有能掃除由微滴板自身、板孔內標本的非特異吸收、指紋、刮痕、塵埃等對特異顯色測定吸光度的影響的利益。比色成果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現按劃定用吸光度（absorbence，A），兩者意義相同。