1 材料 

1.1 細胞 

大鼠心肌細胞株 H9c2（購買于中國醫學科學院協和醫學院基礎醫學細胞中心）。 

1.2 藥品與試劑

 附子樣品共 4 批，購自四川江油中壩附子科技發展有限公司，產地分別為云南（批號：HSPYN）、陜西漢中（批號：HSPSXHZ）、四川江油（批號：HSPSCJY 和 HSPSCJY1）。新（中國食品藥品檢定研究院，批號：110799-201608）；DMEM 培養基（美國 HyClone 公司，批號：AE）；胎牛血清（美國 Gibco 公司，批號 A10112-2770）；0.25 % 胰 蛋白酶（美國HyClone 公司，批號：MHE86395）；青、*（美國 Hyclone 公 司，批 號：AB，J170012）；CCK-8（碧云天生物 技 術有限責任公司，批號：）；PBS（北京益美源生物科技有限責任公司，）。 

1.3 儀器 

MCO-15A 型 CO2 培養箱（日本三洋電機國際貿易有限公司）；YUETAN 型超凈工作臺（北京半導體設備一廠）；DT5-6A 型臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司）；Axioobserver 倒置顯微鏡（德國 ZEISS 公司）；Multiskan FC 型酶標儀（美國Thermo 公司）；ME104E 型電子分析天平（瑞士梅特勒 - 托利多公司）；其林貝爾QL-901 型渦旋儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；96 孔細胞培養板及培養瓶（美國 Corning 公司）

2 方法

附子水提物由中國中藥有限公司制備，制備方法如下：分別稱取黑順片 200 g，浸泡 30 min，煎煮2 次，第 1 次加 9 倍量水，煎煮 30 min，第 2 次加 7倍量水，煎煮 25 min，200 目篩過濾，65℃減壓濃縮，測定濃縮液密度及干膏得率，冷凍干燥制備成凍干粉備用。4 個批次（批號：HSPYN、HSPSXHZ、HSPSCJY、HSPSCJY1）的附子水提物的干膏得率分別為 21.42%、9.85%、8.79% 和 15.26%。附子水提物：精密稱取各批號附子水提物凍干粉，加入 DMEM *培養基溶解。使用 0.22μm濾膜過濾雜質，配制為 0.25 mg·mL-1 附子水提物母液，再用 DMEM *培養基稀釋至相應工作濃度，現用現配。新：精密稱取新粉末，加入去離子水溶解，使用 0.22μm 濾膜過濾雜質，配制為 18 mg·mL-1 母液。凍存于 -20℃，使用時加入 DMEM *培養基稀釋至相應工作濃度，現用現配。H9c2 細胞培養于 DMEM 培養基（含 10 % 胎牛血清，100 U·mL-1 青、*，4 mM L- *）中，置于 37℃，5%CO2 及飽和濕度的培養箱中培養。加入 1 mL 0.25% *按照 1：3 比例傳代培養。取對數生長期細胞進行后續實驗。

3 結果

結果顯示，各密度下 H9c2 細胞在 0 ～ 48 h 為增殖期，48 ～ 60 h 到達平臺期，60 ～72 h 進入衰亡期。當細胞密度為 2×105/mL 時，細胞生長過快，不利于下一步實驗。故選用 0.5×10/mL 或1×105/mL 密度進行下一步實驗。預實驗結果顯示附子水提物溶解濃度為250 μg·mL-1，因而選擇給藥濃度 125 μg·mL-1作為藥物測試濃度；新作為陽性對照藥，濃度選擇為 100 μg·mL-1。結果顯 示，當細胞密度為 0.5×105/mL，作用時間為 12 h 時，附子水提物和新對細胞增殖抑制作用較強，且作用穩定，RSD<15%。故選用 0.5×105/mL，藥物作用 12 h 進行后續實驗。

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