基因重組酵母是一種利用基因重組技術(shù)，將外源 目的基因轉(zhuǎn)錄至酵母細(xì)胞中，使之表達(dá)相應(yīng)蛋白的酵 母。重組人代謝酶酵母能夠表達(dá)人肝微粒中不同亞 型的 CYP450 酶，與其他表達(dá)系統(tǒng)（如大腸埃希菌、 哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞等）相比，具有重組酶表 達(dá)量和催化活性相對(duì)較高、生產(chǎn)周期短以及適合于大 批量制備藥物代謝物等優(yōu)點(diǎn)，因而具有突出優(yōu)勢(shì)。 Dragan 等通過重組人 CYP2C9 酵母全細(xì)胞反應(yīng)體 系，制備了雙氯芬酸的代謝物，但是不同藥物的化學(xué) 結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)各不相同， 因此利用重組人 CYP450 酵母全細(xì)胞反應(yīng)體系進(jìn)行不同藥物代謝途徑及代謝 物的篩選仍存在一定困難。

LC-2010AHT 高效液相色譜儀（日本島津公司）； 渦旋振蕩器 XW-80A（海門市其林貝爾儀器制造有限 公司）；玻璃珠（美國(guó) Biospec 公司，直徑為 0.5 mm）； 48 孔板（無(wú)錫耐思生物科技有限公司）。

重組人 CYP2C9 酵母、 未轉(zhuǎn)染酵母和 4-羥基雙 氯芬酸（純度≥98.0%）由南京珼瑞斯生物醫(yī)藥科技有 限 公 司 提 供 。 還 原 型 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 磷 酸 （NADPH）再生系統(tǒng)試劑購(gòu)自匯智泰康生物技術(shù)（北 京）有限公司。 Lowry 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Yeast Nitrogen Base W/O Amino acids 和 PMSF 購(gòu)自北京索萊 寶科技有限公司。 雙氯芬酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）和LHistidine 購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社（TCI）。 Leu Minus media 購(gòu)自北京泛基諾科技有限公司。 Yeast Extract 和 Tryptone 購(gòu)自英國(guó) Oxoid 公司。 葡萄糖和 DL二硫蘇糖醇（DTT）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限 公司。 三（分析純）和二水合 EDTA 二鈉購(gòu)自南 京化學(xué)試劑股份有限公司。 蔗糖購(gòu)自西隴科學(xué)股份 有限公司。 瓊脂粉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

玻璃珠用濃鹽酸浸泡 24 h，濾去濃鹽酸，用去離 子水洗滌至中性，在 60℃烘箱中干燥 16 h，于 4℃保 存。 使用前，將預(yù)處理后的玻璃珠置于冰上備用。

Yeast Nitrogen Base W/O Amino acids 6.7，L-Histidine 0.02，葡萄糖 20，瓊脂粉 20（制備固體培養(yǎng)基時(shí)添加）。 使用前，于 115℃滅菌 30 min，葡萄糖配制成 20%溶液?jiǎn)为?dú)滅菌。

Yeast Extract 10，Tryptone 20， 葡萄糖 20，瓊脂粉 20（制備固體培養(yǎng)基時(shí)添加）。 使用 前，于 115℃滅菌 30 min，葡萄糖配制成 20%溶液?jiǎn)?獨(dú)滅菌。

將甘油中保存的未 轉(zhuǎn)染酵母菌接種至 YPD 固體培養(yǎng)基上， 放置生化培 養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3 d（30℃）。 3 d 后取 16 個(gè)單顆菌落（直 徑≥2 mm）， 轉(zhuǎn)移至含有 1400 ml YPD 培養(yǎng)基的 2 L 三角培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng) 3 d（30℃，200 r/min）。 離心稱重， 按照菌重與培養(yǎng)基體積比 1∶1 加入 YPD 培養(yǎng)基，于 4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

將甘油中保存 的重組人 CYP2C9 酵母菌接種至 SD-His 固體培養(yǎng)基 上，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5 d（30℃）。5 d 后取 16 個(gè)單顆 菌落（直徑≥2 mm），轉(zhuǎn)移到含有 200 ml SD-His 液體 培養(yǎng)基的 500 ml 三角培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng) 40~48 h（30℃、 200 r/min）。 40~48 h 后將培養(yǎng)基全部轉(zhuǎn)移至 2 L 的三 角培養(yǎng)瓶中， 并加入 1400 ml YPD 培養(yǎng)基， 培養(yǎng) 2 d （30℃、200 r/min）。 離心稱重，按照菌重與培養(yǎng)基體積 比 1∶1 加入 SD-His 培養(yǎng)基，于 4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

10%蔗糖，0.1 mol/L pH 7.4 磷 酸 鉀 緩 沖 液 ，0.1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L EDTA（臨用前加入 1 mmol/L PMSF）。

取所培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染 酵母菌菌液 5 ml（約含酵母菌 2.5 g），離心除去 YPD培養(yǎng)基，按菌重與緩沖液體積比 1∶1 加入酵母微粒體 緩沖液，渦旋使之充分混懸。將混懸液分裝入 2 ml EP 管中，使得每個(gè) EP 管中含有 1 ml 混懸液（約含酵母 菌 0.5 g），并分別加入 0.5 g 玻璃珠，在渦旋振蕩器上 渦旋振蕩 30 次（每次渦旋振蕩 30 s，冰上冷卻 60 s）， 離心（1000 g，10 min）取上清，再次離心（5000 g，1 h） 取 上 清 ， 上 清 即 為 未 轉(zhuǎn) 染 酵 母 微 粒 體 混 懸 液。 于-20℃保存。

CYP2C9 酵母微粒體（制備條件為渦 旋振蕩 30 次，0.5 g 玻璃珠）反應(yīng) 0 h 和 1 h 樣品及未 轉(zhuǎn)染酵母微粒體反應(yīng) 0 h 和 1 h 樣品的 HPLC 檢測(cè)結(jié) 果色譜圖。 雙氯芬酸、代謝物 4-羥基雙氯芬酸及內(nèi)標(biāo) *在“1.2.6”項(xiàng)的 HPLC 色譜條件下分離度良 好，保留時(shí)間分別為 11.08 min、5.13 min 和 3.74 min。 僅在重組人 CYP2C9 酵母微粒體反應(yīng) 1 h 的樣 品 HPLC 圖譜中發(fā)現(xiàn)雙氯芬酸代謝物 4-羥基雙氯芬 酸的色譜峰，而其他樣品的 HPLC 圖譜中未 出現(xiàn)此峰（圖 1A、1C 和 1D）。

CYP2C9 酵母微粒體蛋白 活性的影響 探討渦旋振蕩次數(shù)對(duì)所制備微粒體蛋白活性的 影響時(shí)，玻璃珠的用量為 0.5 g。 隨著渦旋振蕩次數(shù)的 增加，所制備酵母微粒體蛋白含量呈增加趨勢(shì)，在渦 旋振蕩次數(shù)為 50 次時(shí)， 蛋白含量趨于穩(wěn)定， 約為 22.49 mg/ml（圖 2A）。 代謝物 4-羥基雙氯芬酸的生成 量在渦旋振蕩次數(shù)為 30 次時(shí)， 為 1.82 μg ，且單位時(shí)間單位蛋白所生成的代謝物量也， 為 0.10 μg/[（mg/ml）·h]（圖 2C），隨后都呈下降趨勢(shì)。

酵母細(xì)胞壁厚實(shí)，影響胞內(nèi)外物質(zhì)的接觸，因 此細(xì)胞破壁對(duì)提高酵母利用率非常重要。 目前常用的 酵母破壁方法有酶解法、超聲波破碎法、勻漿破碎 法和玻璃珠破碎法等，其中玻璃珠破碎法具有操 作簡(jiǎn)單，可以同時(shí)處理多個(gè)樣品，且對(duì)酶活力和環(huán)境 的損害較小等優(yōu)點(diǎn)。 Donnell 等比較了玻璃勻漿 器、珠磨機(jī)、超聲破碎和玻璃珠渦旋振蕩等 7 種破碎 莢膜葡萄球菌酵母細(xì)胞壁提取鋅金屬蛋白的方法，結(jié)果表明玻璃珠渦旋振蕩的方法對(duì)提取鋅金屬蛋白利，蛋白變性量最小。 制備重組人代謝酶酵母微粒 體通常也是采用玻璃珠渦旋振蕩的方法。 為了保 留較強(qiáng)的蛋白活性，避免微粒體蛋白因長(zhǎng)時(shí)間渦旋振 蕩產(chǎn)熱而失活，本研究采用渦旋振蕩 30 s，冰上冷卻 60 s 的方式，重復(fù)多次渦旋振蕩。 研究結(jié)果顯示，所有 不同條件制備的重組人 CYP2C9 酵母微粒體蛋白均 具有一定的活性。