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實時熒光定量 PCR (RT-qPCR)實驗之RNA提取

來源:上海撫生實業有限公司   2023年09月25日 15:35  

實時熒光定量 PCR (RT-qPCR)實驗過程中, RNA的提取是參照全式金生物的Transzol up提取試劑盒完成的。

1、離心機4℃預冷,準備試劑:氯仿、異內醇、75%乙醇(用DEPC水配制)、無RNase的水或DEPC水、無酶吸頭及試管,戴口罩、帽子、無粉乳膠手套;

2、取出轉染建模成功24h后的細胞,吸棄培養液,用1×PBS清洗1次;

3、每10cm2生長的細胞加入1mL的Transzol Up, 放置片刻后使用移液槍吹打細胞使其wan全脫落;

4、用移液槍反復吹吸裂解液直至無明顯沉淀,將裂解液全部轉移至標記好的1.5mL EP管中,室溫靜置5min;

5、往每個EP管中加0.2mL氯仿(Transzol Up體積的1/5),混勻振蕩30s,室溫靜置3min;

6、4℃條件下10000g離心15min,離心后RNA主要分布在上層水相中,體積約50%;

7、轉移上層水相于新的EP管中(約400μL,注意不要吸取到下層),每管加入0.5mL異丙醇 (Transzol Up體積的1/2),顛倒混勻,室溫孵育10min;

8、4℃下10000g離心10min后在管側和管底形成膠狀沉淀,吸棄上清,加1mL 75%乙醇吹懸沉淀;

9、4℃下7500g離心5min后棄上清,盡量吸凈,室溫晾干沉淀5min,依細胞量加入30~100μL的RNA溶解液;

10、55℃~60℃金屬浴10min,-80℃冰箱保存備用。


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