【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】現(xiàn)代顯微成像技術(shù)的基石，建立于去除熒光在樣品中的散射技術(shù)上，典型如共聚焦、多光子、光片成像、三維結(jié)構(gòu)光、組織透明化等。然而，基于光學(xué)的層切技術(shù)常常會(huì)帶來系統(tǒng)成本、時(shí)間分辨率與光毒性的提高，基于生物的層切技術(shù)又會(huì)帶來樣品處理復(fù)雜性的提高。此外，即使是最先進(jìn)的光學(xué)成像技術(shù)，在面對深層樣本的成像中，依然會(huì)由于深層散射而產(chǎn)生離焦背景，影響精細(xì)生物結(jié)構(gòu)的觀察。
 

　　為了提升各種場景下熒光成像的光學(xué)層切性能，北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院席鵬教授、深圳大學(xué)屈軍樂教授合作團(tuán)隊(duì)另辟蹊徑，通過計(jì)算機(jī)視覺與熒光顯微的融合提出了一種暗通道光學(xué)層切算法(Dark sectioning)，他們在Nature Methods雜志以長文(Article)的形式，發(fā)表題為《暗通道光學(xué)層切算法助力熒光圖像離焦背景去除》的研究論文。Dark sectioning僅用單幀圖像即可高效去除圖像的離焦背景，使顯微成像的信背比(SBR)和結(jié)構(gòu)相似性(SSIM)得到大幅提升，為深部生物組織研究、病理診斷及深層活體動(dòng)態(tài)觀測開辟全新可能。
 

　　圖1. (a, b)自然圖像與離焦圖像的暗通道先驗(yàn)處理結(jié)果，(c)點(diǎn)拓展函數(shù)的大小差異導(dǎo)致暗通道圖像差異，以及(d)Dark sectioning處理前后的圖像對比。比例尺：4μm

 

　　Dark sectioning的提出受到自然圖像的暗通道去霧啟發(fā)。暗通道先驗(yàn)理論被廣泛應(yīng)用于自然圖像去霧任務(wù)中，暗通道被定義為圖像局部塊的最小值組成的圖像。在無霧圖像中，暗通道圖像幾乎為0，而在含霧圖像中，暗通道圖像呈全白分布。研究者發(fā)現(xiàn)，暗通道先驗(yàn)還能區(qū)分單色圖像的在焦與離焦信息；同理，暗通道先驗(yàn)也能區(qū)分熒光圖像的背景與在焦信息，這是由于在焦與離焦圖像點(diǎn)拓展函數(shù)大小的差異，如圖1。然而熒光圖像中的離焦背景和自然圖像的霧霾又有著不同：霧霾呈現(xiàn)全局均一性，且自然圖像的像素灰度值代表圖像信息；而離焦背景呈現(xiàn)局部波動(dòng)性，且熒光圖像的像素灰度值代表熒光強(qiáng)度。自然圖像的暗通道去霧技術(shù)直接用于熒光圖像會(huì)帶來弱信號的丟失與背景的不完全去除，因此其并不直接適用于熒光圖像當(dāng)中。
 

　　因此，研究者開發(fā)了適用熒光圖像的背景去除技術(shù)——暗通道光學(xué)層切(Dark sectioning)。Dark sectioning首先通過高低頻分離以保留圖像的弱小信號，僅將低頻部分進(jìn)行去背景處理，并利用物理參數(shù)驅(qū)動(dòng)生成的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)優(yōu)化圖像塊尺寸，在背景去除的過程中，通過更低一級的低通濾波器模擬初始背景分布，從而定量化初始背景，最后通過迭代濾除進(jìn)行單次或多次的背景去除以適用不同程度的背景場景。通過寬場-共聚焦，寬場-光層切，二維-三維結(jié)構(gòu)光，單光子-雙光子的聯(lián)合交叉驗(yàn)證，研究者證明了Dark sectioning能夠基于寬場圖像達(dá)到共聚焦/光層切/雙光子的成像效果，并且能夠在深層組織成像時(shí)進(jìn)一步提升共聚焦/光層切/雙光子的光學(xué)層切能力。
 

　　研究者系統(tǒng)探索了Dark sectioning在多種不同光學(xué)顯微鏡硬件模態(tài)與重建/后處理算法中的應(yīng)用場景，如圖2所示。研究者發(fā)現(xiàn)Dark sectioning不僅能夠適用于寬場成像，光片/光場成像，受激發(fā)射損耗成像，偏振成像等硬件模態(tài)，能夠提高光學(xué)層切與偏振解析能力；更適用于深度學(xué)習(xí)超分，熒光漲落成像、二維/三維結(jié)構(gòu)光照明成像，反卷積等重建/后處理算法，能夠顯著降低二維/三維結(jié)構(gòu)光照明成像偽影，并提升熒光漲落成像(SOFI/SACD)和反卷積的重建分辨率。
 

　　圖2. Dark sectioning適用于各類基于熒光的顯微成像系統(tǒng)與重建/后處理算法中，包括寬場成像，光片/光場成像，受激發(fā)射損耗成像，偏振成像，深度學(xué)習(xí)超分，光學(xué)波動(dòng)成像、二維/三維結(jié)構(gòu)光照明成像，反卷積算法等

 

　　通過計(jì)算機(jī)視覺與熒光顯微成像的組合創(chuàng)新，Dark sectioning無需額外的成像成本，極大地提升了各類熒光成像模態(tài)的層切性能。在未來，其有望集成于各類顯微技術(shù)當(dāng)中實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)去離焦成像，并成為結(jié)構(gòu)光/光場/分割/解卷積/熒光漲落/深度學(xué)習(xí)等重建技術(shù)的通用預(yù)處理手段。值得注意的是，Dark sectioning由于簡單且高效的原理，其處理速度快且泛化性高，研究者為了進(jìn)一步提高用戶友好性，提供了MATLAB程序/函數(shù)，基于Java的Fiji插件以及Exe版本的多平臺Dark sectioning軟件供不同用戶測試使用：https://github.com/Cao-ruijie/Dark-sectioning。
 

　　在本項(xiàng)工作中，席鵬、屈軍樂為該論文的共同通訊作者，北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院博士生曹睿杰和北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院已畢業(yè)的李雅寧博士為共同第一作者。此外，該工作還得到了華中科技大學(xué)費(fèi)鵬課題組、清華大學(xué)吳嘉敏課題組、南方科技大學(xué)李依明課題組、北京大學(xué)李長輝課題組、北京大學(xué)盧閆曄課題組的重要支持與幫助。本工作得到了科技部重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)、國家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的資助。