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RT-PCR反應注意事項

時間:2023/2/20閱讀:413
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逆轉錄-聚合酶鏈反應 ( (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)該技術主要用于:分析基因的轉錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統(tǒng)。

反應注意事項:

1.在實驗過程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中,注意避免mRNA的斷裂。

2.為了防止非特異性擴增,必須設陰性對照。

3.內(nèi)參的設定:主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動蛋白)等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。

4. PCR不能進入平臺期,出現(xiàn)平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標DNA起始的數(shù)量有關。故對于每一個目標序列出現(xiàn)平臺效應的循環(huán)數(shù),均應通過單獨實驗來確定。

5.防止DNA的污染:

① 采用DNA酶處理RNA樣品;

② 在可能的情況下,將PCR引物置于基因的不同外顯子,以消除基因和mRNA的共線性。


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