聚合酶鏈式反應在熱循環設備中進行。PCR儀可以將反應管加熱或冷卻到每步反應所需的精確的溫度。為防止反應體系中液體產生蒸氣，通常在反應管上加蓋加熱的蓋子（比加熱板溫度來的高），或者在反應體系表面加入一層石蠟油。一般PCR反應由20到35個循環組成，包括以下步驟：

1、變性：利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA解螺旋，高溫使兩條DNA鏈間的氫鍵斷裂。在第一個循環之前，通常加熱時間較長以確保模板DNA全分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來機器就控制溫度進入循環階段。

2、退火：將反應溫度降低至50-65℃（通常比引物 值低3-5℃）持續20-40s，從而使引物結合于單鏈DNA上。若退火溫度過低，容易造成非特異擴增，而退火溫度過高，引物可能根本不結合。

3、延伸：此步驟的溫度取決于所用的DNA聚合酶。 Taq（Thermus aquaticus）聚合酶的熱穩定DNA聚合酶的最佳活性溫度約為75–80°C，但通常使用的延伸溫度為72°C。 在這一步驟中，DNA聚合酶通過從反應體系中添加的5'至3'方向的游離dNTP，從而合成與DNA模板鏈互補的新DNA鏈。延伸所需的精確時間取決于所用的DNA聚合酶和待擴增的DNA片段的長度。 傳統的Taq 酶估計合成1000bp大概需要1分鐘、較新的Tbr 酶（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40s、商業公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15s。有修正功能的則會比較慢。

上述循環結束后，將進入終延伸階段：此步驟是可選的，但要在70-74°C）（PCR中使用的大多數聚合酶最佳活性所需的溫度范圍）下進行5-15分鐘。 最后一個PCR循環，以確保所有剩余的單鏈DNA的岡崎片段被補齊。

　　最終保持：最后一步將PCR儀反應室無限期地冷卻至4–15°C，可用于PCR產物的短期保存。