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實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)方法探討2023/10/30
根據(jù)所使用的技術(shù)不同,實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以分為:熒光探針和熒光染料兩種方法?,F(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下:1.TaqMan熒光探針TaqMan探針?lè)ㄊ歉叨忍禺惖亩縋CR技術(shù),其核心是利用Taq酶的3'→5'外切核酸酶活性,切斷探針,產(chǎn)生熒光信號(hào)。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶的3'→5'外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光
ELISA檢測(cè)試劑盒操作過(guò)程注意事項(xiàng)2023/10/23
ELISA檢測(cè)試劑盒操作過(guò)程注意事項(xiàng):1加樣:①實(shí)驗(yàn)樣本過(guò)多時(shí),可分批次操作,以減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)造成的誤差;②加酶試劑后,用吸水紙吸干孔外試劑;③作定量試驗(yàn)時(shí),使用加樣器加注試劑,并經(jīng)常校正其準(zhǔn)確性,此外,要做到一份樣本一個(gè)移液頭,防止交叉污染。2.溫育:①如有兩種溫度,盡量使用較低的溫育溫度、較長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間的條件;②用1個(gè)小溫度計(jì)放置在板孔反應(yīng)液中測(cè)量觀察;③96孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學(xué)梯度會(huì)造成“邊緣效應(yīng)”,因此盡量采用水??;3.洗板:①手工洗板時(shí),拍板時(shí)要垂直,避免交叉污染,用力不
渾濁紅球菌的培養(yǎng)2023/10/17
渾濁紅球菌的培養(yǎng):1、菌種是指食用菌菌絲體及其生長(zhǎng)基質(zhì)組成的繁殖材料。菌種分為母種(一級(jí)種)、原種(二級(jí)種)和栽培種(三級(jí)種)三級(jí)。工業(yè)發(fā)酵的有用菌種,其篩選步驟包括菌種分離、初篩和復(fù)篩。2、挑選具有某種能力的有用菌種,也稱種子制備,是指菌種在一定條件下,經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)成為具有一定數(shù)量和質(zhì)量的純菌種的制備過(guò)程。以作接入發(fā)酵罐中進(jìn)一步擴(kuò)大菌體量及合成產(chǎn)物之用。3、種子制備包括孢子制備和菌絲體制備菌種制備。4、保存在沙土管或冷凍管中的菌種,用無(wú)菌手續(xù)挑取少許,接入瓊脂斜面培養(yǎng)基上,在25℃(或較高溫度
細(xì)胞傳代密度問(wèn)題與解決方案2023/10/08
細(xì)胞傳代密度問(wèn)題與解決方案:1.傳代密度過(guò)高一旦細(xì)胞養(yǎng)太久至融合度過(guò)高(90%)才傳代,容易使細(xì)胞產(chǎn)生老化現(xiàn)象,甚至是堆疊,再消化細(xì)胞時(shí)不易吹打成單顆細(xì)胞,即便再重新鋪盤傳代,細(xì)胞也無(wú)法回到原本的特性了。(如:?jiǎn)螌蛹?xì)胞,沒(méi)長(zhǎng)滿就發(fā)生堆疊現(xiàn)象)解決方案:盡量避免融合度過(guò)高,鏡下觀察融合度約達(dá)到80%即可傳代分盤。細(xì)胞融合度:在細(xì)胞培養(yǎng)中指的是細(xì)胞在培養(yǎng)表面(培養(yǎng)皿/瓶)所占的比例。2.傳代密度過(guò)低哺乳動(dòng)物貼壁培養(yǎng)細(xì)胞,若細(xì)胞培養(yǎng)到80-90%密度需要開始傳代,在傳代接種細(xì)胞密度過(guò)低,細(xì)胞間距離太遠(yuǎn)
?單克隆抗體與多克隆抗體對(duì)比2023/10/03
單克隆抗體(monoclonalantibody,mAb):就是指由單一B細(xì)胞(其基因僅能編碼一種抗體)克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原表位的抗體。單克隆抗體是通過(guò)將抗原注入到宿主動(dòng)物體內(nèi)啟動(dòng)機(jī)體免疫應(yīng)答而產(chǎn)生的。因而制作單克隆抗體的大多數(shù)操作都是在體外將來(lái)自這些宿主的脾細(xì)胞與培養(yǎng)的惡性骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。將du特的細(xì)胞克隆分離出來(lái),融合步驟中存活下來(lái)的細(xì)胞稱為雜交瘤。雜交瘤因骨髓瘤特性而可以永生,且容易在培養(yǎng)物中繁殖。多克隆抗體:用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動(dòng)物,可刺激機(jī)體多個(gè)B細(xì)
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (RT-qPCR)實(shí)驗(yàn)之RNA提取2023/09/25
實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,RNA的提取是參照全式金生物的Transzolup提取試劑盒完成的。1、離心機(jī)4℃預(yù)冷,準(zhǔn)備試劑:氯仿、異內(nèi)醇、75%乙醇(用DEPC水配制)、無(wú)RNase的水或DEPC水、無(wú)酶吸頭及試管,戴口罩、帽子、無(wú)粉乳膠手套;2、取出轉(zhuǎn)染建模成功24h后的細(xì)胞,吸棄培養(yǎng)液,用1×PBS清洗1次;3、每10cm2生長(zhǎng)的細(xì)胞加入1mL的TranszolUp,放置片刻后使用移液槍吹打細(xì)胞使其wan全脫落;4、用移液槍反復(fù)吹吸裂解液直至無(wú)明顯沉淀,將裂解液全部轉(zhuǎn)移
賴氨酸(Lys)含量測(cè)定試劑盒Lys含量計(jì)算2023/09/11
測(cè)定原理:蛋白質(zhì)中的賴氨酸(lysine,Lys)具有一個(gè)游離的ε-NH2,它與茚三酮試劑反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì),其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與賴氨酸的含量成線性關(guān)系。亮an酸與賴氨酸的碳原子數(shù)目相同,而且僅有—個(gè)游離氨基(ε-NH2),所以通常用亮an酸配制標(biāo)準(zhǔn)液。賴氨酸含量計(jì)算:a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下:標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y=0.0062x-0.0212;x為賴氨酸含量(µg/mL),y為吸光值。1.按照蛋白濃度計(jì)算賴氨酸含量(µg/mgprot)=[(△A+0.0212)÷0.
I型膠原單克隆抗體穩(wěn)定性良好原因2023/08/28
抗體在室溫、37℃保存與-20℃保存具有一樣的活性與穩(wěn)定性。之所以這種抗體具有這樣良好的穩(wěn)定性,主要原因有四個(gè)方面:1.抗體純度高純度的抗體產(chǎn)品,去除了包括各種蛋白酶在內(nèi)的雜質(zhì),保證了抗體的穩(wěn)定性。采用先進(jìn)的抗體純化技術(shù),確保抗體產(chǎn)品的高純度,保障其抗體產(chǎn)品的穩(wěn)定性。2.抗體濃度高濃度的抗體產(chǎn)品可減少容器表面吸附造成的物質(zhì)損失。撫生抗體產(chǎn)品中,93%的濃度大于0.5mg/ml??贵w產(chǎn)品濃度普遍大于業(yè)內(nèi)水平。3.抗體的穩(wěn)定性是自然界長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果抗體是免疫系統(tǒng)中最重要的分子之一,其穩(wěn)定性是自然進(jìn)化
ELISA的檢測(cè)收集標(biāo)本注意事項(xiàng)2023/08/21
ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡(jiǎn)稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。ELISA的檢測(cè)目的是為了實(shí)驗(yàn)提供準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)依據(jù),為了保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必須堅(jiān)持全面的質(zhì)量控制和全過(guò)程質(zhì)量控制,在收集標(biāo)本前都必須有一個(gè)完整的計(jì)劃。注意事項(xiàng):1、每個(gè)樣本量收集體積=100ulx檢測(cè)種類,如果要做復(fù)孔,標(biāo)本量收集體積=100ulx檢測(cè)種類x22、樣本收集后若在一周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)可保存于2-8°C,若不及時(shí)
ELISA試驗(yàn)樣本實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備2023/08/17
樣本實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:ELISA進(jìn)口試劑盒液體樣本:包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等。1、血清室溫血液自然凝固10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。2、血漿:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。3、尿液:用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集
配置常用細(xì)胞培養(yǎng)配套試劑詳述2023/08/07
幾種常用細(xì)胞培養(yǎng)配套試劑的配置(緩沖液、平衡鹽溶ye等)。1、無(wú)鈣、鎂、離子溶液(1000ml)氯化鈉(NaCl)8g磷酸二氫na、(NaH2PO4H20)0.05g、碳酸氫na(NaHCO3)1g、檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7,H20)1g、葡萄糖1g、加去離子水或雙蒸水至1000mL2、PBS(Phosphate-Bufferedsaline)磷酸鹽緩沖液甲液:0.2mol/L磷酸氫二na溶液、磷酸氫二na(無(wú)水)28.4g、氯化鈉8.77g加去離子水或雙蒸水至1000mL乙液:0.2mo
生化液體型試劑解析2023/08/01
無(wú)論是單試劑還是雙試劑型試劑,目前乃至今后仍以液體型為主要?jiǎng)┬?。其?yōu)點(diǎn)是液體型試劑的試劑組分高度均一,瓶間差異小,測(cè)定重復(fù)性好而且使用方便;它也無(wú)需加入輔助試劑及蒸餾水,防止了外源性水質(zhì)對(duì)試劑的影響,性能較穩(wěn)定,測(cè)定結(jié)果比較準(zhǔn)確。缺點(diǎn)是液體型試劑(尤其是酶試劑)保存時(shí)間較短,不便于運(yùn)輸。1.液體單試劑所謂液體單試劑就是將某種生化檢驗(yàn)項(xiàng)目所用到的試劑科學(xué)地混合在一起,組成為一種試劑。應(yīng)用時(shí),只須將標(biāo)本和試劑按比例混合,即可進(jìn)行相應(yīng)的生化反應(yīng),然后用適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)結(jié)果。應(yīng)用十分方便。2.液體雙試劑所
PCR對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好,目的片段不理想分析2023/07/17
對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好,卻沒(méi)有回收到目的片段,實(shí)驗(yàn)出了什么問(wèn)題?參考見解:1連接用室溫保溫1小時(shí),能滿足大多數(shù)克隆,為提高效率,需4oC過(guò)夜。2插入片段帶有污染,使3`-T缺失,或抑制連接,抑制轉(zhuǎn)化。為此,將插入片段和pGEM-T正對(duì)照混合,再連接。如降低了對(duì)照的菌落數(shù),插入片段需純化,或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑,插入片段污染有核酸酶,使pGEM-T或pGEM-TEasy載體3`-T缺失。3插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段,因受UV過(guò)度照射,時(shí)有發(fā)生。UV過(guò)度照射會(huì)產(chǎn)生嘧啶二聚體,不利于連接,
?菌種的培養(yǎng)分析2023/07/10
菌種的培養(yǎng):1、菌種是指食用菌菌絲體及其生長(zhǎng)基質(zhì)組成的繁殖材料。菌種分為母種(一級(jí)種)、原種(二級(jí)種)和栽培種(三級(jí)種)三級(jí)。工業(yè)發(fā)酵的有用菌種,其篩選步驟包括菌種分離、初篩和復(fù)篩。2、挑選具有某種能力的有用菌種,也稱種子制備,是指菌種在一定條件下,經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)成為具有一定數(shù)量和質(zhì)量的純生產(chǎn)菌種的制備過(guò)程。以作接入發(fā)酵罐中進(jìn)一步擴(kuò)大菌體量及合成產(chǎn)物之用。3、種子制備包括孢子制備和菌絲體制備菌種制備,其中(1)~(4)為孢子制備過(guò)程。4、保存在沙土管或冷凍管中的生產(chǎn)菌種,用無(wú)菌手續(xù)挑取少許,接入瓊
ELISA試劑盒特異性影響因素2023/06/26
ELISA試劑盒特異性影響因素:1、固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種,以微量滴定板最為常見。它具有良好的吸附性能,孔底透明度高,空白值低,各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此,在選擇試劑盒同時(shí)要對(duì)其使用的微孔板型號(hào)進(jìn)行認(rèn)證,評(píng)估。2、包被物的純度。在酶聯(lián)免疫測(cè)定尤其是間接ELISA中,試劑的特異性取決于使用抗原的純度。目前由于技術(shù)條件的限制,包被用抗原或抗體的純度不可能達(dá)到100%
PCR反應(yīng)靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染解答2023/06/12
PCR反應(yīng)出現(xiàn)假陽(yáng)性,一是引物設(shè)計(jì)不合適:選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。二是靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:1、整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決:1)、操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣器內(nèi)或?yàn)R出離心管外。2)、除了酶及其他不耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及進(jìn)樣槍頭均應(yīng)一次性使用。3)、必要時(shí),
ELISA實(shí)驗(yàn)精確性的方法技術(shù)要點(diǎn)2023/06/05
免疫檢測(cè)法的精確性表現(xiàn)為單次實(shí)驗(yàn)孔間(批內(nèi))的重復(fù)性和多次實(shí)驗(yàn)之間(批間)的重復(fù)性。CV值高則表明精確度低,通常由以下兩個(gè)原因造成:移液技術(shù)和洗滌技術(shù)。一、移液技術(shù)1.移液時(shí),槍頭應(yīng)對(duì)準(zhǔn)孔,避免接觸孔壁及底部。2.移液后輕輕晃動(dòng)混勻試劑。3.如果您的樣品具有黏性,請(qǐng)預(yù)先潤(rùn)洗槍頭以消除表面張力的影響。吸液時(shí)等待片刻使體積平衡后再取出。4.移液不充分或移液體積不均,說(shuō)明移液器需要校正。必要時(shí)請(qǐng)檢查移液器并重新校正。5.加樣時(shí),不同的試劑標(biāo)準(zhǔn)品和樣本間都要確保更換槍頭,避免交叉污染。6.確保使用合適的
ELISA試劑盒的各種類集合2023/05/29
ELISA試劑盒產(chǎn)品,國(guó)內(nèi)分裝配置,大大減少了客戶因?yàn)閮r(jià)格高而必須購(gòu)買國(guó)產(chǎn)試劑盒的需求,經(jīng)優(yōu)化的試劑盒組分可有效的阻止ELISA試劑盒假陽(yáng)性和假陰性試驗(yàn)結(jié)果。跟著科技的開展,ELISA試劑盒被越來(lái)越多的用于疾病診斷、食品安全檢測(cè)中,那么ELISA試劑盒的可以分為下面幾類:1、細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒:如白介素、選擇素、集落刺激因子,腫瘤壞死因子,干擾素,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子,趨化因子,細(xì)胞因子受體,粘附分子,生長(zhǎng)因子,凋亡因子等等心肌梗塞檢測(cè)ELISA試劑盒如肌鈣蛋白,肌紅蛋白,C-反應(yīng)蛋白等等2、內(nèi)分泌檢測(cè)
凍存原代細(xì)胞的培養(yǎng)操作步驟2023/05/23
原代細(xì)胞(primaryculturecell)是指從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞。有人把培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。原代細(xì)胞不僅廣泛應(yīng)用于分子、細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究,如蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、細(xì)胞株(系)研究、DNA,RNA和遺傳學(xué)研究等。凍存原代細(xì)胞的培養(yǎng)操作步驟:1.將一管細(xì)胞從液氮罐中取出,注意保護(hù)手和眼睛。2.將凍存管快速的放入37℃水浴中,輕輕握住并旋轉(zhuǎn),直到管內(nèi)物體*融化。3.將凍存管立即從水浴中拿出,擦干,轉(zhuǎn)入無(wú)菌環(huán)境。4.用70%的酒精沖洗凍存管,
檢測(cè)細(xì)胞衰老具體流程2023/05/15
細(xì)胞衰老是細(xì)胞在正常環(huán)境條件下發(fā)生的功能減退、逐漸趨向死亡的現(xiàn)象。衰老的細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞體積變大,呈扁平狀;細(xì)胞核變大,核膜內(nèi)陷,染色質(zhì)聚集、固縮、裂解;胞質(zhì)內(nèi)顆粒增加,有空泡形成;線粒體的數(shù)目及形狀發(fā)生改變;膜流動(dòng)性降低;溶酶體內(nèi)容物增多,導(dǎo)致溶酶體酶β-半乳糖苷酶活性升高。衰老細(xì)胞所具有的上述特征成為各種細(xì)胞衰老檢測(cè)手段的依據(jù)。檢測(cè)細(xì)胞衰老具體流程:1、細(xì)胞接種前在6孔培養(yǎng)板中預(yù)先放置滅菌的細(xì)胞片,每孔加入1×10E5個(gè)細(xì)胞,37℃5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜,使細(xì)胞在細(xì)胞片上生長(zhǎng)。2、在超凈工作
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